目前，世界上的植物遺傳基礎趨向單一化，一些地方品種及珍貴稀有的作物資源也從地球上逐漸消失。因此世界各國對種質資源的收集和保存都非常重視，近幾十年來，液氮超低溫保存技術發(fā)展迅速，為種質資源的保存開辟了新的途徑。液氮罐

1 液氮超低溫保存技術原理及優(yōu)點

通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫。超低溫冷凍保存一般以液態(tài)氮為冷源，使保存溫度維持在-196℃。生物材料在如此低溫下，新陳代謝活動基本停止，處于"生機停頓"(Suspanded animation)狀態(tài)。這就有可能極大地延長儲存材料的壽命，而不產生遺傳變異，從而有效地、安全地長期保存那些珍貴稀有的種質。 利用液態(tài)氮保存植物種質，液氮冷凍容器就是液氮罐。除了1～2個月補充一次液氮外，不需要機械空調設備及其它管理，節(jié)省了大量的人力和物力。并且可以保持被保存組織及細胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性。因此比其它保存方法有著很大的優(yōu)點。

2 基本程序

2.1 材料的準備與選擇

超低溫保存的材料一般選擇處在指數(shù)增長的細胞材料。如愈傷組織的超低溫保存一般選擇培養(yǎng)18～24d的培養(yǎng)物作為材料。

2.2 預處理

使保存材料達到適合于超低溫保存的生理狀態(tài)。主要是提高分裂相細胞的比例的減少細胞內自由水含量。

2.3 放入冰浴

將材料裝入試管或其他保存容器中，并隨既插入冰浴中。

2.4 加入保護劑

加入0℃預冷冰凍保護劑，在0℃冰浴中放團置30～45min。

2.5 降溫冰凍

（1）直接投入液氮。

（2）程序慢速0.05～5℃/min降溫到投入液氮。

（3）慢速降溫到預凍溫度（-30℃），停留一段時間（1～3h）后投入液氮。

（4）逐級降溫后投入液氮，如：0℃——-10℃（5min）——-15℃（5min）——-23℃（5min）——-30℃（5min）——-40℃（5min）——-196℃（液氮）。

2.6 保存后的化凍

一般在37℃～40℃溫水中快速化凍。

2.7 活力鑒定

通常采用TTC法，也稱氯化三苯四液唑還原法。如果是單細胞或原生質體，可以采用活性熒光素染色法，顯示活細胞，統(tǒng)計存活率。

2.8 再培養(yǎng)

觀察組織細胞恢復生物的速度，存活率，植株的再生能力。

2.9 遺傳性狀分析

植株形態(tài)特征，生長發(fā)育，染色體、同工酶譜及抗逆性等。

3 影響超低溫保存效果的因素

3.1 材料的特性

包括植物的基因型，抗凍性，器官、組織和細胞怕年齡、生理狀態(tài)等。這些因素對眧低溫保存效果有很大的影響，從而要求在整個保存處理過程中采取相應的，符合其特性的各種適宜的措施。比如材料如果是含量有液胞小、含水量小的細胞（如莖尖分生組織等），可用用快速降溫冰凍方法。含液胞大、含水量高的細胞的則一般需要采用慢速降溫法律等等。

3.2 預處理

是為了使保存材料達到超低溫保存所要求的生理特性：增加細胞分裂與分化的同步化。減少細胞慛自由水的含量。增強細胞的抗寒力。主要的方法有以下幾種。

3.2.1 細胞、組織繼代培養(yǎng)中，細胞分裂分化同步化調控。L.A.Withers等指出，有絲分裂前或稍后的細胞抗凍能力強，處于這個時期的細胞在超低溫保存后存活率高。

3.2.2 預培養(yǎng)：增加培養(yǎng)基中的糖濃度，提高滲透壓。或者在預處理培養(yǎng)基中加入誘導抗寒力的物質或冰凍保存劑，如脫落酸、山梨醇、二甲亞砜等。

3.2.3 低溫鍛煉：一些植物如康乃馨、蘋果等的莖尖在液氮保存前經過低溫鍛煉可以提高存活率。液氮罐

另外，有些報道中采用上述幾種方法結合處理達到效果。

3.3 冰凍保護劑

作為冰凍保存劑的物質需要具備發(fā)下特性：（1）易溶于水。（2）在適當?shù)臐舛认聦毎菬o毒的。（3）化凍后容易從組織細胞中少清除。常用的冰凍保護劑有二甲基亞砜、甘油、糖的糖醇為物質等。

3.4 降溫冰凍方法

材料經冰凍保護劑在0℃預處理30～40min后，要立即降溫冰凍，最后到達液氮中保存，降溫方法是影響超低溫保存效果的關鍵因素之一，所以它在超低溫保存技術體系中一直是注意較多的一個方面。一般根據(jù)不肉中刺的保存對象有四種不同的降溫就去：快速冰凍法、慢速冰凍法、兩步冰凍法、逐級冰凍法。

3.5 化凍方法

大量的實驗證據(jù)表明，植物的凍害常常是發(fā)生在冰凍和化凍兩個過程中，因此除了需要有一個合適的降溫冰凍程序外，還要有一個合適的化凍方法，以避免在化凍過程中產生細胞內的次生結冰。并防止在化凍吸水過程中水的滲透沖擊對細胞膜體系的在破壞。一般采用快速化凍法。即將液氮保存后的材料在37-40℃的溫水浴中化凍。因數(shù)超低溫冰凍材料化凍時，再次結冰的危險區(qū)域是-50℃～10℃.從理論上講可以借助迅速的化凍速度通過此溫度區(qū)，從而可以避免細胞內的次生結冰。但是如果材料是木本科和冬芽，那么在超低溫保存后必須在0℃低溫下進行慢速化凍才能達到良好效果，因為冬芽已經經過低溫鍛煉，細胞內的水分已經在限度地流到細胞外結冰，快速化凍時會受到猛烈的滲透沖擊，從而會導致細胞膜的破壞，因此需要慢速解凍

4、在果樹質資源保存中的應用

4.1 花粉

最早在1922年，H.E.Knowlton就已經在金魚草花粉方面取得了一害的成功。他把金魚草花粉冷凍到-180℃后，仍然獲得了一定程度的花粉的超低溫成功保存已有許多報道。已經取得成功的有桃、李、木瓜、棗椰、鱷梨、胡桃等許多樹種。日本的Yatabe果樹試驗站利用超低溫保存技術已經保存了桃的60個栽培品種和品系的花粉，時間已達十年以上。

4.2 種子

種子在-18℃，含水量（5+1）%的情況下其新陳代謝仍然發(fā)生，導致生活力衰退。特別是執(zhí)拗型種子的壽命更短，難以保存。超低溫保存技術可以克服這些不利因素，使種子保存更為長久。目前果樹方面利用超低溫保存種子有檸檬、海棠等。

4.3 枝條、芽及莖尖分生組織

由于莖尖分生組織細胞分化程度小，倍性一致辭，遺傳上比較穩(wěn)定，且在離體條件下容易再生新植株，因此，莖尖的種質保存意義重大。枝條、芽也是保存無性繁殖植物種質的方便途徑。1978年日本學者就已報道了蘋果、梨、醋栗等果樹冬芽超低溫保存的成功。此后在蘋果、草莓等果樹莖尖保存中也取得了成功。

4.4 幼胚及胚狀體

單倍體細胞在遺傳上是不穩(wěn)定的，超低溫保存將是保持單倍體穩(wěn)定性的有效途徑。據(jù)Y.P.S.Bajiaj報道，柑桔的珠心胚經過液氮保存后存活率為24%～28%。

4.5 組織及細胞

愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細胞的超低溫保存也是果樹種質資源保存的一個有途徑。在酸櫻桃、甘蔗、草莓等的愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細胞的超低溫保存方面取得成功。

4.6 原生質體

原生質體具有多種用途，特別是在開辟果樹育種方面有著廣闊的前景，它是進行細胞雜交和基因工程的基礎材料。對原生質體的超低溫保存有著更大的優(yōu)越性：與具有細胞壁的細胞相比，它降低了冰凍的危害，能得到更高的存活率。但是原生質體的超低溫保存要求較高，果樹原生質體的超低溫保存報道較少。馬峰旺等（1998）報道，杏的一些品種的懸浮培養(yǎng)物分離的原生質體超低溫保存后成活率可達40%。液氮罐

超低溫保存技術在種質資源保存方面已經取得了很大的成就，相信隨著超低溫技術的發(fā)展，在這一方面的應用會愈加成熟，這一技術也必將為保持地球生態(tài)多樣性作出更大的項獻。